Tissuelyser-48快速勻漿植物組織

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摘要：本文介紹了一種用于PCR的植物基因組DNA的快速制備方法。該方法只需將少量（4～6mg）植物葉片、適量（200μl） TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細胞研磨器中振動1min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡單快速、成本低、擴增效果好等優點，特別適合于大量樣品的基因型檢測。

王蘭1, 2   龍云銘2  劉耀光2
1 華南農業大學農學院，廣東省植物分子育種重點實驗室
2 華南農業大學生命科學學院，廣東省教育廳植物功能基因組與生物技術重點實驗室

摘要：本文介紹了一種用于PCR的植物基因組DNA的快速制備方法。該方法只需將少量（4～6mg）植物葉片、適量（200μl） TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細胞研磨器中振動1min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡單快速、成本低、擴增效果好等優點，特別適合于大量樣品的基因型檢測。

關鍵詞: 水稻，DNA制備，PCR

隨著生物技術的迅速發展，PCR技術已廣泛應用于遺傳育種的各個領域，如種子純度鑒定、親緣關系的分析、分子標記輔助育種、基因定位以及轉基因植株檢測等。在大規模的基于PCR的基因型檢測作業中，快速的模板DNA制備顯得非常重要。自Marmur 1961年建立用十二烷基磺酸鈉（SDS）和氯仿從生物細胞中分離提取DNA樣品的經典方法以來,人們一直致力于對DNA抽提方法的探討，并先后報道了一些關于DNA抽提的方法（Dellaporta et al., 1983; 宣樸等，1998；汪秀峰等，2002；周淑芬等，2004）。但這些方法仍然煩瑣費時。本研究對作為PCR模板的植物基因組DNA制備方法作了簡化,只需將少量葉片、適量TE緩沖液、和一粒鎢合金珠放入離心管，在組織細胞研磨器中振蕩約5min破碎組織后，直接取1μl DNA溶液作為PCR的模板。本方法具有簡單快速、成本低、擴增效果好等優點，特別適合于大規模的基因型檢測。

1材料與方法

1.1 試驗材料
試驗材料為粳稻品種臺中65（T65）及其雜種不育基因Sc的近等基因系E5，以及它們雜交組合構建的F2群體，以及擬南芥（Arabidopsis thaliana）生態型Columbia。

1.2 基因組DNA制備方法
剪取（或用手摘取）水稻苗或成株葉片（剪成約3～5mm小段）或擬南芥葉片約4～6mg，12～15mg，或25～30mg，放入2ml離心管中（注：2ml離心管的底部較寬，利于鎢合金珠的振蕩），加入200μl TE （10mmol/L Tris, pH8.0; 0.5mmol/L EDTA, pH8.0. 注：本TE中的EDTA濃度是常規TE的1/2）或200μl去離子水，放入一粒3mm直徑的鎢合金珠（Qiagen, Cat.69997），在多功能組織細胞研磨器（老型號MTM-60/現升級成Tissuelyser-48）上振動約1min，把葉片打碎。取17μl溶液以瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA質量，取1μl溶液用于PCR擴增。

1.3 PCR引物反應
根據公共數據庫的水稻和擬南芥基因組序列設計PCR引物（表1），由英俊公司合成。Taq酶從杰順公司購買。

表1  PCR引物序列

引物

引物序列

PR1

5’-TCTGTACAAGTTGAGGAATCTCCG-3’

5’-TGCCACCCACAGCAAGCCTTATGA-3’

PR2

5’-ACCCCATGGCGACGAATTCC-3’

5’-CAGATTAAGGCAGGAAGTCC-3’

PA

5’-GAAACTGATCAGTTGCTTTCAC-3’

5’-CTGCTACACAATCTCGTTATGGAG-3’

L14-121

5’-CTTGACAATTGCAAGGCCAA-3’

5’-GAGGTAGGCATGAGACATGC-3’

J04-91

5’-GTGCGGATCGATCGGCAGCA-3’

5’-GCTCAGATCCGGCCAGATTC-3’

P24-83

5’-CAGAACAGCATTCAGGCATC-3’

5’-ATCCTGATAATGTGTGGCGC-3’

P24-93

5’-CATTGGTTAAAGGATGGTAC-3’

5’-TAGTACTGCTAGGACCATCC-3’

注：PA為擬南芥引物，其余為水稻引物，其中L14-121～P24-93為插入/缺失（InDel）標記引物。

每個PCR反應液（20μl）組成為：1× Buffer，0.2mmole/L dNTPs, 1U Taq酶,250nmole/L每種引物，1μl上述DNA溶液。PCR反應在My Cycler （BioRad）熱循環儀上進行。用引物反應程序為94℃預變性3min，擴增35個循環，每個循環94℃ 20s， 55~58℃ 30s，72℃ 60s （InDel標記的PCR用30s）；后72℃ 2min。

1.4 聚丙烯酰胺凝膠電泳及檢測　

1.4.1 聚丙烯酰胺凝膠的制備
配制6%的聚丙烯酰胺凝膠100ml工作液:分別加5.7 g丙烯酰胺 （Acri），0.3g N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis-Acri），12g尿素，10ml 10×TBE，后加水至100ml。灌膠前，每10ml膠液加入80μl 10%過硫酸銨，4μl四甲基乙二胺（TEMED）,搖勻后迅速灌膠，膠凝固后即可點樣電泳，并通過銀染檢測實驗結果。

1.4.2 銀染　
先用0.1% AgNO3染色液染色10～15min，再用顯影液（100mL中含NaOH 0.5g、四硼酸鈉0.019g, 0.4mL甲醛）顯色,等條帶清晰后，直接用自來水沖洗終止顯色反應，用凝膠成像儀（BioRad）或數碼相機拍照并記錄實驗結果。

2結果與討論

2.1 PCR模板DNA的快速制備
本方法是將少量植物葉片在TE溶液或去離子水中，經鎢合金珠在離心管內的振蕩破碎，直接獲得DNA溶液。用多功能組織細胞研磨器（MTM-60）一次可操作60個樣品。瓊脂糖凝膠電泳表明，用TE和去離子水都可獲得分子量較大的DNA 片段（圖1A）。用TE制備的DNA在4℃下可保存10天以上，在冷凍下可保存半年。而用去離子水制備的DNA容易降解，保存時間較短，因此我們采用TE為主。

圖1 本方法制備的水稻和擬南芥基因組DNA。

注：A: 用TE（泳道1～5）和去離子水（泳道6～10）制備的水稻基因組DNA （4～6mg葉片/200μl）。 M為分子量標記。B, C: 用200μl TE制備的不同濃度的水稻（B）和擬南芥（C）基因組DNA。泳道1～3為4～6mg葉片；4～6為12～15mg葉片；7～9為約25～30mg葉片。

2.2 不同量的模板DNA的PCR擴增效果
本方法制備的基因組DNA沒有經過純化，含有各種可能抑制Taq酶活性的雜質。因此，加入過多的粗制DNA可能會影響PCR反應。為了找出適合于PCR反應的DNA量，我們在一定量的TE（200μl）中加入不同量（4～6mg、12～15mg和25～30mg）的水稻和擬南芥葉片制備基因組DNA（圖1，B, C）。選用2對水稻的引物（PR1、PR2，擴增產物長度分別為540bp和890bp）和1對擬南芥引物（PA, 擴增產物長度為1 kb），取1μl DNA在20μl的體系進行PCR反應。結果表明，對擴增較小的DNA 片段，所有模板都能擴增出產物，但用4～6mg葉片制備的模板DNA獲得好的擴增效果（圖2A）。對擴增較大的DNA  片段，只有用4～6mg葉片制備的模板DNA獲得較穩定的擴增效果（圖2B, C）。

圖2 不同量的基因組DNA為模板的PCR反應的瓊脂糖凝膠（1％）檢測

注：A，B，C分別為用引物PR1，PR2，和PA進行PCR。在所有反應（20μl）含有1U Taq酶和1μl基因組DNA；泳道1～3，4～6，7～9分別為以4～6mg，12～15mg，和25～30mg葉片在200μl TE中制備的基因組DNA。

本實驗說明，用4～6mg（可以多至約10mg）葉片/200μl TE的比例制備基因組DNA溶液所含的雜質濃度較低，加入1μlDNA溶液到20μl反應體系中不會抑制Taq酶的活性。而加入1μl較高濃度的模板DNA對PCR反應的抑制作用較大。由于模板DNA量較少（約1～2ng/μl），PCR循環數比用較大量的純化DNA模板（一般用20~50ng）的PCR要多些（多3～5個循環）。雖然可以將用較多葉片制備的模板DNA稀釋使用或加入較少量（<1μl）的模板DNA也能獲得好的PCR效果，但從簡化操作步驟，提高工作效率考慮，確定佳的經驗值對效率化的大規模樣品檢測尤為重要。由于加入的樣品葉片量有一個合適的范圍，在實際操作中，并不需要所有樣品都用天平稱取，以經驗目測估算即可。

2.3用于分子標記的基因型分析
由于用本方法制備的基因組DNA可以PCR擴增出較大的目的片段，對于PCR分子標記，如微衛星（SSR）、插入/缺失（InDel）、單核苷酸多態（SNP）等檢測較短的DNA 片段（一般<200bp）應該是可行的。我們用4對位于水稻秈粳雜種花粉不育基因Sc（Yang et al., 2008）連鎖區的InDel標記引物（表1）對F2群體進行的基因型分析。圖3顯示了部分結果，所有標記的PCR擴增效果穩定，聚丙烯酰胺凝膠電泳的DNA條帶均清晰易辨。

圖3  用InDel分子標記的水稻基因型檢測

注：A～D分別為用引物L14-121，J04-91，P24-83，和P24-93的PCR。左邊起第1和第2泳道分別為親本E5和T65、其它泳道均為F2個體。

已報道植物基因組DNA制備的方法很多，如經典的SDS法、CTAB法，另外還有一些簡化的制備方法,如SDS一步法（王會文等，2002）、微波爐水煮法（黃小樂等，2002）、TE研磨法（羅文永等，2002）、NaOH處理幼葉直接作為PCR模板法（汪秀峰等，2002）、簡易提取法（陳文岳等，2005）、剪切法（趙紅霞等，2006）。對需要對大量樣品進行基因型分析的研究來說，這些方法的操作效率不夠高，或制備的模板DNA的擴增結果不理想，常常不能擴增出目的片段。本研究提出的DNA制備方法簡單，大大縮短了時間，適合操作大量的樣品，而且PCR效果和重復性好，需要葉片量也很少，所需的儀器（多功能組織細胞研磨器）價格低，因此實驗成本低。我們用本方法已制備了數萬的水稻樣品用于各種分子標記（SSR、InDel、SNP）和轉基因的基因型檢測。

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